Séquençage des petits ARN
Les petits ARN non codants (ncRNA, smallRNA) et les microRNA (miRNA) sont des régulateurs majeurs de l’expression des gènes, de la formation de l’hétérochromatine et de l’organisation du noyau. Leur action est dépendante du tissu, de l’environnement, et par des mécanismes variés, a une influence capitale dans les cancers et de nombreuses maladies.
L’extraction des petits ARNs est une étape délicate. Plusieurs méthodes sont proposées: à partir des ARN totaux, les petits ARNs seront séparés par électrophorèse sur gel, par élution à travers une membrane de silice ou par purification sur billes magnétiques (Wong et al.).
La préparation des banques en vue du séquençage NGS n’est pas sans difficulté puisqu’elle présente un haut risque de biais de représentation des petits RNA et de contamination par les dimers d’adaptateurs (Coenen-Stass et al.).
En bref, le protocole suit les étapes suivantes: rajout d’un adaptateur spécifique à chaque extrémité des molécules d’ARN, conversion les ARN en cDNA double brin (transcription reverse) incluant selon les kit l’indexage des molécules (UMI) et enfin amplification. Les banques sont ensuite contrôlées sur Bioanalyseur (Agilent) et quantifiées au QuBit (Invitrogen).
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