Regulome

La technique BiSeq (Bisulfite sequencing) repose sur le traitement de l’ADNsb au bisulfite de sodium qui désamine les C non methylée (C) plus rapidement que les C méthylées (5mC et 5hmC). Ce traitement qui converti les C en Uracil puis en T après amplification (Fig1) permet de transformer la marque épigénétique en variation génétique identifiable par séquençage (WS Yong et al. 2016) .

Le protocole BiSeq consiste à préparer des fragments d’ADN par sonication , les indexer avec des adaptateurs methylés puis les sélectionner par la taille. Les banques sont ensuite traités au bisulfite de sodium, amplifiés et séquencés. La réaction de conversion peut être vérifiée en intégrant un ADN contrôle non méthylé, sachant qu’un temps d’incubation excessif ou qu’un mauvais ration bisulfite/ADN non seulement dénature l’ADN mais surtout peut modifier les C méthylées avec pour résultat une  sous-estimation de l’état de méthylation de l’échantillon (PW Laird. 2010).

L’analyse de données BiSeq est complexe par le fait que la conversion crée une transition C=>T sur chaque position de chacun des brins d’ADN. Pour chaque locus séquencé devront être alignés le brin « riche » en G, son complémentaire « riche » en C, le brin converti « riche » en A et son complémentaire « riche » en T (Fig1). La méthode « BiSeqS » (AK Mattox et al. 2017) introduit un barcodage moléculaire pour discriminer l’état de méthylation de chacun des 2 brins d’ADN et simplifier l’analyse.