scRNAseq
L’analyse du transcriptome au niveau de la cellule unique permet de mettre en évidence l’hétérogénéité cellulaire de tissus complexes et tumoraux, d’identifier des sous populations cellulaires rares et de suivre la dynamique de l’évolution cellulaire au cours du développement ou en fonction de son environnement (interactions cellulaires, pathogènes, traitements, etc).
La méthode s’appuie sur la capture des quelques molécules (~105) d’ARN polyadénilés de la cellule, l’ajout de quelques deoxycystidines en 3’ du 1er brin cDNA grâce à la particularité de la reverse transcriptase du virus de la leucémie murine (MMLV). Ces nucléotides additionnels sont complémentaires d’un TSO (template switching (TS) oligo), qui permet à la reverse transcriptase de «switcher» pour répliquer le 2nd brin du cDNA vers l’extrémité 5’.
Plusieurs protocoles sont disponibles selon la méthode d’isolement des cellules et le projet d’étude (Figure).
- Encapsulation des cellules en gouttelettes (10X Genomix Chromium)
- Dropseq utilise la capture des mRNA sur billes par un oligo polydT portant barecodes et UMIs. Cette méthode rapide permet le séquençage des régions 3’ et le comptage des transcrits.
- Le symétrique du Drop seq consiste à utiliser, fixé au billes, un oligo TSO conjugué avec barecodes et UMIs. Dans cette configuration, ce sont les fragments 5’ qui seront séquencés.
- Indexage « combinatoire sur des pools de cellules.
- Split-Seq (Rosenberg et al. 2018) est une méthode qui ne nécessite aucun instrument d’isolement cellulaire. Par ligations aux cDNAs de barecodes/UMIs à chaque tour de « split and pool », chaque transcrits aura un indexage combinatoire particulier et spécifique d’une cellule. Cette méthode est efficace pour l’étude des profils d’expression génique et l’identification de populations cellulaires.
- Tri cellulaire (FACS, Fluidigm C1, CellenOne)
- Smartseq 2 (Picelli et al. 2014) : Cette méthode se distingue des précédentes par l’introduction d’un LNA ( locked nucleic acid) à l’extrémité 3’du TSO afin d’obtenir un meilleur rendement de la synthèse des cDNAs. Utilisable aussi sur de l’ARN total, cette méthode permet l’étude des transcrits sur toute leur longueur et la détection d’isoformes d’épissage.
- Smartseq 3 : Dans cette version, la séquence du TSO est différente et incorpore des UMIs pour s’affranchir des biais de PCR et optimiser le comptage des transcrits.
